科学家开发了一种多重PCR测序面板,对癌症的治疗帮助很大!

   电子分析员        

靶向治疗已经成为治疗大多数癌症的首选方法,包括转移性乳腺癌。使用液体活检,可以作为一种动态诊断工具,是一个有吸引力的概念,以确定有效的治疗。为了在单细胞水平上识别循环肿瘤细胞(CTCs)的突变,研究人员开发了基于多路pcr的下一代测序面板。利用细胞搜索系统富集CTCs,通过微操作分离,然后对其DNA进行全基因组扩增。然后对PIK3CA、ESR1、AKT1和ERBB2基因的突变热点区域进行扩增和条形码编码。在MiSeq系统上进行测序。该实验在显示预期突变的不同细胞系的细胞上得到验证。在所有被分析的基因中,13名患者中有10人发现了为潜在靶向治疗提供基础的突变。在四个病人身上,观察到一个以上基因的突变——要么在同一个细胞,要么在不同的细胞,这表明存在不同的肿瘤细胞克隆,这可能是联合治疗的目标。该试验是一种时间和成本效益的工具,以调查最相关的基因组位置指示的靶向治疗转移性乳腺癌。它可以支持治疗决定,以改善癌症患者的治疗。


相关论文以题为“A Multiplex PCR-Based Next Generation Sequencing-Panel to Identify Mutations for Targeted Therapy in Breast Cancer Circulating Tumor Cells”发表在《Applied Sciences》上。




在过去的几十年里,靶向治疗已经成为治疗大多数癌症的首选方法。然而,获取信息以选择靶向治疗是具有挑战性的:复发或转移病灶的活检具有侵袭性,当临床情况恶化或肿瘤无法达到时不能进行活检。此外,活检组织的基因组图谱提供了一个局限于空间和时间上的单一点的图像,因此,可能不能充分代表瘤内异质性。组织活检的预测效用受到这些因素的限制,而在应对内源性和外源性选择压力时,肿瘤的持续进化则进一步恶化。通过液体活检获得原发肿瘤或转移病灶的信息,可以作为一种动态诊断工具,是克服这一挑战的一个很有吸引力的概念。


潜在的生物标志物是循环肿瘤细胞(CTCs)和循环肿瘤DNA (ctDNA)。CTCs被肿瘤组织转移到血液中,通常被认为是形成转移的前体细胞。ctDNA作为游离DNA的一部分,描述了血液中循环的肿瘤DNA,它由降解的肿瘤细胞释放。


进一步突变可以作为治疗乳腺癌的目标是位于ESR1 AKT1基因ERBB2: ESR1基因编码的雌激素受体α(ERα),核激素受体参与基因表达的调控影响细胞增殖和分化。内质网外受体的配体结合结构域突变导致蛋白构象的改变和不依赖配体的内质网抑制激活,主要是在抗雌激素剥夺治疗中获得的,如芳香化酶抑制。AKT1是丝氨酸-苏氨酸激酶类的成员,在细胞生长、增殖、存活和血管生成等过程中发挥关键作用。某些AKT1突变导致mTOR通路的过度激活。受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2 (HER2/neu (HER2))激活RAS/MAPK、PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路,促进细胞增殖和存活。编码胞外结构域和激酶结构域的热点区域突变导致蛋白及其下游通路的激活。


为了利用细胞搜索系统富集的CTCs识别乳腺癌靶向治疗的突变,研究人员开发了基于pcr的多路下一代测序(NGS)面板。细胞搜索系统已经被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌患者的CTCs。


试验的发展


考虑到单个CTCs的基因组DNA是使用基于MseI限制的方法扩增的,研究人员的目的是开发一个基于pcr的多路NGS面板来识别与转移性乳腺癌靶向治疗相关的CTCs突变。研究人员纳入了乳腺癌中经常突变的PIK3CA、ESR1、AKT1和ERBB2基因的热点区域。在PIK3CA基因中,5、10和21外显子的热点区域被覆盖。在ESR1基因中,分析了5、7、8外显子的热点区域。在AKT1基因中,研究人员研究了外显子3和ERBB2基因的热点区域,研究人员的分析覆盖了外显子8、18、19和20的热点区域。每个扩增子检测一组引物,选择最特异的引物组合进行多重PCR。对第一次PCR中的引物浓度进行滴定,结果在测序后每个片段的引物浓度分别为7.0%±1.4%和10.2%±0.8%。总的来说,研究人员达到了95.3%±0.9%的目标读数。


然后,研究人员对由Ampli1质量控制确定的一组不同质量的CTCs进行测序,并比较其覆盖范围。对于质控PCR扩增出4条条带的DNA质量最高的细胞,可以观察到平均每个细胞的10.2±1.3个片段的覆盖率(图1)。覆盖率与质控PCR检测的质量相关。质量控制PCR中显示3条或4条条带的细胞与少于3条条带的细胞相比,覆盖度显著增加(p <0.0001双尾t检验)。因此,研究人员将重点放在在质量控制PCR中显示至少3条条带的细胞上,以便进一步分析以获得可靠的结果。



图1.覆盖碎片的数量与WGA产品的质量有关。p值(p<0.0001)采用双尾t检验。误差条表示标准差。每组分析10 ~ 30个细胞。


试验的验证


为了验证这一实验,研究人员使用来自四种不同突变细胞系的细胞进行了spike in实验。对这些细胞进行处理时采用的工作流程与后来用于临床样本的工作流程相同。作为阴性对照,研究人员分析了在分析区域无突变的富her2乳腺癌细胞株Sk-Br-3的细胞。管腔乳腺癌细胞系T47-D和MCF7细胞预计分别显示PIK3CA突变H1047R和E545K。此外,研究人员还分析了带有ESR1突变E380Q和AKT1突变E17K的转移性腔内乳腺癌患者DLA产物的长期培养CTCs。所有被调查的细胞都显示出预期的突变,证明了研究人员的分析的可靠性(图2)。



图2.参考细胞系的细胞测序数据。显示的值显示变异等位基因频率。空框表示未检测到突变。LTC,长期培养。


分析转移性乳腺癌患者的CTCs以确定靶向治疗


在细胞系细胞验证后,研究人员分析了13例转移性乳腺癌患者的CTCs。其中11例为原发性腔内亚型肿瘤,2例诊断为三阴性乳腺癌。细胞搜索分析检测出每7.5毫升血液中有6到15340个CTCs。中位CTC计数为每7.5毫升血液94例。在研究人员的研究中,每个患者分析1到15个CTCs。


在7名患者中,发现了PIK3CA基因的突变。这些突变中的5个是位于编码N345、E545和H1047氨基酸的核苷酸三联体中描述良好的突变。在两名患者的CTCs中检测到ESR1突变。在L536的编码三联体中,有一个位于一个著名的热点区域。在3例患者的CTCs中,研究人员发现AKT1突变E17K,在5例患者的CTCs中,研究人员发现ERBB2基因突变,包括编码S310、L755和V777的核苷酸三联的热点突变(图3)。



图3.来自CTCs的测序数据。显示的值显示变异等位基因频率。空框表示未检测到突变。


结论


几乎所有患者的CTCs均存在异质性,这种异质性表明肿瘤内存在不同的亚克隆,因此患者可能会受益于针对不同蛋白的联合治疗。然而,不能排除的是,观察到的假设异质性可能至少部分是由于在WGA过程中等位基因丢失造成的错误负性造成的。因此,没有突变并不一定意味着这些突变在初始细胞中不存在。等位基因缺失的一个例子是T47-D参考细胞3:在该细胞中,只有突变的等位基因在WGA期间被放大。这种等位基因缺失的影响限制了所有分析单细胞DNA的方法。随着DNA完整性的降低,等位基因丢失的可能性增加。为了使其最小化,研究人员重点分析了在质量控制PCR中显示至少三个条带的WGA产品。


总之,研究人员已经开发了一个时间和成本效益的多路pcr为基础的分析MiSeq系统。研究人员的分析涵盖了乳腺癌靶向治疗的最相关位置,从而可以改善治疗决策,最终帮助改善癌症患者的治疗。


论文链接:https://www.mdpi.com/2076-3417/10/10/3364/htm



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